【科普】穿越歷史的酵母菌－基因工程與啤酒風味的纏綿史

     啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是與啤酒密不可分的親密伴侶。人類利用酵母菌製酒已有至少8000年的歷史(McGovern et al., 2004)，如今不同的酒廠各自擁有特殊基因序列的酵母菌品系，成了獨家風味的關鍵密碼，尤其近幾年精釀啤酒崛起，不斷挑戰創新的工藝風潮所帶動的技術發展。

【你的名字是？👤】

    過去在維京人的家庭都會有一支被當作傳家寶的木勺，每次釀酒都要使用這支寶貝攪一攪，做出來的啤酒才會成功。1516 年，德國頒布了一項巴伐利亞啤酒純釀法令(The Reinheitsgebot)，規定製造啤酒只能使用麥芽、水、啤酒花作為原料，直到 1860 年酵母菌被微生物學家 Louis Pasteur 發現，人們才意識到那家傳木勺之所以神奇的原因，這項純釀法令也才將酵母添列為啤酒的原料之一。

  丹麥微生物學家 Emil Christian Hansen 在 1883 年成功分離出啤酒酵母菌純細胞後，為他取了個相當得體的學名「Saccharomyces cerevisiae」，「Saccharo-」是糖的意思，「-myces」是真菌的意思，而「cerevisiae」則為發酵的意思，整體描述了酵母菌是個很愛吃糖的真菌，可說是見其名如見其菌。

    酵母菌之所以重要，除了平常很愛吃甜滋滋生兒子(長輩緣上升)，他還有兩個被點滿的主要技能：千年來的發酵作用以及近代發展的基因工程平台。

【發酵作用－你會，獨眼龍也會😎】

    廣義來說，發酵作用指的是「將大分子物質轉換成小分子物質」的過程，也稱之為生物轉化作用(Biotransformation or Bioconversion)。以製作啤酒為例，酵母菌利用麥芽(malt)中的麥芽糖(maltose)做為發酵原料，產生酒精、二氧化碳以及許多具有獨特氣味的化學物質，構成了啤酒的特殊風味，這些風味物質包含了乙醛(Aldehydes)、酯類(Ester)、酮類(Ketones)與酸類(Acids)等。(Heitmann et al, 2017)

    狹義來說，發酵作用是細胞利用葡萄糖進行無氧糖解作用，不需經過粒線體(mitochondrion)，在細胞質中即利用糖解作用產物丙酮酸(pyruvate)的還原途徑產生乘載電子的有機物質，例如酵母菌產生酒精，人類於是利用這個特性來製作啤酒與葡萄酒，乳酸菌產生乳酸能夠用來製成優酪乳，醋酸菌可製造食醋。

    從上述例子看來，許多細菌都能夠發酵，酵母菌又是何德何能，穩坐人類數千來最友好的微生物寶座呢？

↑跟酵母菌好朋友乾一杯!

【瑰柏翠效應－吃貨的戰爭武器】

     「瑰柏翠效應 (Crabtree effect)」使酵母菌搶食葡萄糖能力特別突出。此一名詞是於1929年由英國生化學家 Herbert Grace Crabtree 首度發表，研究團隊發現癌症細胞能夠以無氧糖解作用代謝葡萄糖，產生大量ATP與乳酸，細胞質內大量的受質磷酸化作用(Substrate-level phosphorylation)產生高濃度的 [ATP]/[ADP+Pi] ，過量的乳酸轉而進行糖質新生作用，除了導致能量不斷被消耗，粒線體內以氧氣做為電子載體的呼吸作用也被抑制，使正常細胞無法獲得真正的能量。(Crabtree, 1929)

    到了1965 年，比利時微生物學家 Deken 等人發現 50% 的酵母菌菌種具有瑰柏翠效應，啤酒酵母是其中一種。研究指出，當葡萄糖與果糖作為酵母菌的主要碳源時，即使是在「有氧」的環境中，酵母菌仍會優先進行「無氧糖解作用」，同樣的生化作用在有氧環境下的酵母菌身上換了個專有名詞，變成所謂的「有氧發酵」作用。這種有氧與無氧環境皆能生存的微生物，又被稱為兼性厭氧菌，由於有氧發酵作用的酵母菌能產生較多二氧化碳，釀造者多應用在製作麵包上，無氧發酵作用能產生較多的酒精，因而多被應用在釀酒。(De Deken, 1966)

    有氧環境除了讓其他雜菌較難與酵母菌競爭葡萄糖發酵，酵母菌產生的酒精(暗箭)也對其他雜菌的生存造成抑制作用，兩種生存策略發揮效果使酵母菌成為發酵液汁中的優勢菌種。反之，科學家發現若給予甘露糖和半乳糖作為主要碳源時，酵母菌細胞內的發酵作用與呼吸作用將同步進行。

  1997年 De Vit 等人認為此一現象背後的調控機轉是由 Mig1 所操控。Mig1 是一種鋅手指蛋白(Zinc Finger Protein)，其結構組成為 Cys2-His2 (兩個半胱胺酸和兩個組胺酸)。該團隊發現，當葡萄糖存在於酵母菌培養液時，即可觀察到 Mig1 進入細胞核內，與複合體蛋白 Ssn6-Tupl 共同抑制呼吸作用酵素的啟動子(promoter)基因序列；反之若是移除培養液中的葡萄糖，則能夠觀察到 Mig1 離開細胞核，回到細胞質中。(De Vit et al., 1997)

【人在江湖飄，哪有不挨刀🔪】

    縱使擁有優秀的葡萄糖搶食能力，酵母菌偶爾也會被別的微生物的暗箭射個正著。這些雜菌暗箭並不會直接殺死他們，而是誘發酵母菌產生[GAR+]普恩蛋白(Prion protein)，使得其不再視發酵液中的葡萄糖為唯一碳源，轉而使用別的六碳醣作為養分來源，讓其他雜菌有機可趁，得以搶過葡萄糖作為養分來源，同時酵母菌所產生的酒精減少，其他雜菌便趁勢成為優勢菌種，造成發酵作用停滯與失敗。

    值得一提的是，用來釀造啤酒的酵母菌由於菌種單一，且發酵原料為煮沸滅菌過的麥芽汁，使得釀造啤酒的酵母菌株與雜菌的競爭能力較弱；相對來說，釀造葡萄酒的酵母菌株經常以未滅菌的果汁或葡萄果漿作為發酵原料，與釀造啤酒的酵母菌比起來較能抵抗雜菌的暗箭。(Jarosz e al., 2014)

(De vit et al., 1997)

↑ 圖左，葡萄糖的存在使 Snf1 失活，並使得 Mig1 透過 Reg1/Glc7 磷酸酶複合體去磷酸化活化，移動進入酵母菌細胞核中抑制呼吸作用酵素的啟動子。圖右則是移除葡萄糖後，Mig1因磷酸化作用失活而離開酵母菌細胞核。

【酵母菌跟我們都略懂略懂的基因工程又有什麼關係？🍻】

    基因工程技術融合了遺傳學、分子生物學以及微生物學的背景，使基因能夠跨物種表達，不再受限於物種的藩籬。到了 1977 年，真核生物外源基因已經能夠利用大腸桿菌 Escherichia coli 表達，卻礙於原核生物的轉錄、轉譯與轉譯後修飾作用等真核生物細胞機制不同，加上產毒素的特性，使其在藥物與食品產業中的應用受限。(Meyhack et al., 1989)

    為此，科學家開始轉而尋求其他模式生物進行更多研究。啤酒酵母不僅為真核生物、又被美國食品藥物管理局視為可食用的GRAS (General Regard as Safe) (GRAS Notice No. 350)安全等級微生物，種種有利條件使之成為新的基因工程模式生物。除了與大腸桿菌同樣能夠快速繁殖以外，酵母菌無性生殖的單倍體(Haploid)使真核生物外源基因在大量表現時更加穩定，另一方面有性生殖配對(mating)的雙倍體(Dipoloid)使內源基因有效重組。1996 年 10 月 25 日，著名科學期刊 Science 更宣布酵母菌的基因定序被完整破解(Goffeau et al., 1996)，是世界上第一個基因體被完全定序的真核生物，史丹佛大學亦設有完整的酵母菌基因資料庫 Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/) ，並收錄以酵母菌作為模式生物的研究文獻，供更多科學家研究使用。(Cherry et al., 1996)

    酵母菌基因工程技術的進展使人類在醫藥學、分子生物學、遺傳學研究等基礎研究領域有諾貝爾獎等級的重大發現，在發展了數千年之久的食品發酵工程上更是如虎添翼。

↑ 酵母菌的一生。酵母菌為真核單細胞生物，其單倍體與雙倍體皆能穩定存在於環境中， a  與 α 兩種單倍體配子可配對成 a\α 雙倍體酵母菌。

【基改酵母與啤酒，有搞頭嗎？🍻】

  

    基於酵母不僅為 GRAS 等級，日益突破的基因工程技術，加上近來植物香氣的化學成分與生化合成路徑不斷地被鑑定出來，目前已有許多利用酵母菌的生物轉換作用來催化合成香料的研究報告發表，顯示二十一世紀的香料產業正因微生物合成技術有所轉變。(Forti et al., 2018)

    利用基因改造技術，能產出我們想要的啤酒風味嗎？

    前文提到，釀造啤酒的原料為水、麥芽、酵母與啤酒花。以原料的成本、發酵時間等因素考量來區分啤酒種類的話，又可以將啤酒分成工業啤酒與精釀啤酒兩類。若以流行音樂和獨立音樂來比喻的話，工業啤酒是屬於大眾化、製造流程制式化、變化不大，比較容易為大眾所接受的流行音樂，而精釀瓶酒則富含實驗性、創造性、風味層次多變化，受到小眾歡迎的獨立音樂。近年來，精釀啤酒無論在國外或台灣都有越來越受歡迎的趨勢。以精釀啤酒的創造元素來看，不外乎是從於麥芽、酵母菌、啤酒花品系和水質種類的混和搭配來創造新風味。

【不喜歡啤酒的口味嗎？】

    由於精釀啤酒需要嘗試不同酵母菌株的發酵成果，以求多層次風味的變化，多種不同基因型的酵母菌被雜交創造出來。這些變異啤酒酵母的目的之一，是為了要減少酵母菌在發酵過程中產生某種不太討喜的丁香味，其氣味來源物質被稱為 4 - 乙烯基 - 愈創木酚 (4-vinyl guaiacol, 4VG)。比利時勒芬大學 Kevin Verstrepen 的研究團隊因而研發出一套基因測序技術，篩檢 PAD1 與 FDC1 基因的變異狀況，成功地從 153 株酵母菌中篩選出 4VG 產量較低的酵母菌。該研究團隊並進一步篩選出能夠抵抗較高酒精濃度的酵母菌株，這代表著透過篩選酵母菌的基因型，生產風味更佳、酒精濃度更高的啤酒是可能的。(Forti et al., 2018; Mertens et al., 2017)

【用更低的價格產生風味更好的啤酒是可能的嗎？】

    啤酒原料中最昂貴、最難掌控的就屬啤酒花了。啤酒花最初是用來保護啤酒，避免腐敗，同時提供啤酒花特殊的苦味(hoppy flavor)平衡麥芽汁的甜味。種植啤酒花作物每年在美國消耗1000億公升的水資源，而珍貴啤酒花精油、樹脂在每一批啤酒花的含量比例又有所差異，要保持啤酒一致的風味並不容易，更不用說 2008 年間全球啤酒花供應量劇減了3、4成的慘況，連中國最大啤酒花栽植區的甘肅省也受到波及，面對如此困境，市場對啤酒花風味的需求在近 20 年反倒有增加的趨勢。

    今年年初，美國柏克萊大學研究團隊在 Nature 雜誌發布了一項研究結果，將薄荷(mint)和羅勒(basil)中的外源基因轉殖到酵母菌中，成功地使啤酒製程中不額外添加啤酒花，也能夠透過酵母菌產生啤酒花風味。經品評試驗鑑定，群眾喜愛的美國天然啤酒花品種「Cascade hop」氣味來源為單萜成分的沉香醇(Linalool)以及香葉醇(Geraniol)，該成分是透過基因改造酵母菌的麥角固醇合成路徑（Ergosterol biosynthesis pathway）合成。事實上，早在2000年與2008年即有利用酵母菌合成沈香醇與香葉醇的研究報告出爐，本研究的突破在於能夠更精確地調控路徑中基因表達程度，以控制香氣成分的產量與比例，將有望改善啤酒花長期以來需要消耗大量資源栽種的狀況，以及採收品質、採收量不穩定的問題。(Denby et al., 2018; Forti et al., 2018)

(Denby et al., 2018)

↑ 不需添加啤酒花的啤酒，利用薄荷、羅勒與酵母菌基因重組直接產生啤酒花風味的物質沉香醇與香葉醇。

     由於基因改造食品法規的問題，這樣子的啤酒目前只能在實驗室生產出來，尚未在市面上銷售。利用基因改造酵母調整啤酒風味在目前看來仍是一個相當瘋狂且不易達成的技術，然而全球暖化造成農產品收穫不穩定的問題，勢必使得低汙染、易操作、成本更低的微生物生質技術成為一股無法被忽略的力量。

※感謝 Edward 協助校稿。

圖片來源：

1. http://t.cn/Rmi59w3

2. http://t.cn/RmXw4lU
3. http://t.cn/RmFhBA4

參考資料：

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3.De Deken, R., The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Microbiology 1966, 44 (2), 149-56.

4.De Vit, M. J.; Waddle, J.; Johnston, M., Regulated nuclear translocation of the Mig1 glucose repressor. Mol. Biol. Cell 1997, 8 (8), 1603-18.

5.Denby, C. M.; Li, R. A.; Vu, V. T.; Costello, Z.; Lin, W.; Chan, L. J. G.; Williams, J.; Donaldson, B.; Bamforth, C. W.; Petzold, C. J., Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nat. Commun. 2018, 9 (1), 965.

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7.Goffeau, A.; Barrell, B. G.; Bussey, H.; Davis, R.; Dujon, B.; Feldmann, H.; Galibert, F.; Hoheisel, J.; Jacq, C.; Johnston, M., Life with 6000 genes. Science 1996, 274 (5287), 546-67.

8.Heitmann, M.; Zannini, E.; Axel, C.; Arendt, E., Correlation of Flavor Profile to Sensory Analysis of Bread Produced with Different Saccharomyces cerevisiae Originating from the Baking and Beverage Industry. Cereal Chem. 2017, 94 (4), 746-51.

9.Jarosz, D. F.; Lancaster, A. K.; Brown, J. C.; Lindquist, S., An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell 2014, 158 (5), 1072-82.

10.McGovern, P. E.; Zhang, J.; Tang, J.; Zhang, Z.; Hall, G. R.; Moreau, R. A.; Nunez, A.; Butrym, E. D.; Richards, M. P.; Wang, C. S.; Cheng, G.; Zhao, Z.; Wang, C., Fermented beverages of pre- and proto-historic China. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2004, 101 (51), 17593-8.

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13. 自釀啤酒聖經"How To Brew" 台灣中文版 
14. 啤酒花市場行情下跌 最大啤酒原料基地陷危機